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1材料與方法

下游引物P，下劃線處分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點。上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。L基因的克隆與鑒定以綿羊痘病毒基因組DNA為模板，采用50μL體系進行PCR擴增。將純化的PCR產物與mple克隆載體連接，并將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆培養后小量制備質粒進行酶切鑒定，并測序。綿羊痘病毒E3蛋白的生物信息學分析將測序結果應用NCBI數據庫ORFfinder程序推導出相應的氨基酸序列，并應用Weblab服務器中法對SPPVE3蛋白和VVE3蛋白的核苷酸和氨基酸序列進行比對。二級結構、蛋白質柔性區域分析分別使用軟件的法和法進行預測。蛋白中氨基末端和羧基末端2個功能域的三級結構使用SWI服務器進行預測。重組載體的構建及重組蛋白的誘導表達、純化E3L重組載體和表達載體pGEX4T－1分別用酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，16℃連接過夜，并轉化至DH5α感受態細胞。毒株綿羊痘病毒古浪株由中國農業科學院家畜疫病病原生物學國家重點實驗室分子免疫與環境控制課題組分離、鑒定和保存。主要試劑TaqDNA聚合酶、載體、大腸桿菌菌株連接酶、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司；pGEX4T－1表達載體表達菌、GST結合樹脂和硝酸纖維素膜購自公司；氨芐青霉素、IPTG、弗氏佐劑和辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗山羊IgG購自Sigma公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自公司；化學發光底物購自公司；X光底片、顯影及定影液均購自柯達公司；其他試劑均為進口分析純。引物的設計與合成根據GenBank中登錄號為的基因組序列，利用軟件設計了1對引物，預期擴增產物的大小為534bp。上游引物P，挑取陽性克隆培養后小量制備質粒進行酶切鑒定，并測序。將鑒定正確的重組載體轉化至BL21（DE3）pLysS感受態細胞，37℃振蕩培養至時，加入IPTG至終濃度為1mmol／L誘導培養離心10min收集菌體，處理后進行檢測。用裂解緩沖液重懸誘導表達的菌體，在冰浴條件下進行超聲破碎（超聲5s，停8s）至溶液澄清，離心，分別取上清和沉淀進行SDS－PAGE，分析重組蛋白SPPVE3的可溶性。重組蛋白使用Novagen公司的GST結合樹脂進行純化。重組蛋白鼠抗血清的制備及分析選取周齡的BALB／c小鼠進行免疫：初次免疫時，用純化后的重組蛋白SPPVE3與等量弗氏完全佐劑混合，經乳化后皮下多點注射；第14天，用相同劑量的重組蛋白與弗氏不完全佐劑混合，乳化后加強免疫。二免后第14天采血，分離血清，用純化的重組蛋白SPPVE3包被ELISA板，進行間接ELISA試驗，測定血清效價。

2SPPVE3L基因的序列分析與結構預測經測序分析

SPPVE3L基因全長534bp，編碼177位氨基酸，分子質量約為。使用法分析，基因與VVE3L基因的核苷酸序列具有50．8％的一致性，在氨基酸水平上具有34．9％的一致性（50．0％的相似性。從功能結構域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列與E3蛋白ZDBD相比具有28．2％的一致性（47．4％的相似性），而羧基末端與DRBD相比具有41．9％的一致性（52．7％的相似性）使用法預測蛋白的二級結構，發現α－螺旋主要存在于位氨基酸；β－折疊主要分布于位氨基酸；利用法預測蛋白質柔性，結果表明較大的柔性區域分布于位氨基酸。根蛋白結構預測服務器，對SPPVE3蛋白的氨基末端和羧基末端2個潛在的功能結構域氨基酸序列進行蛋白三級結構的同源建模。構建的氨基酸區域分別為3～71和102～173位氨基酸，參考模板分別為E3蛋白的Z－DNA結合域和PKR的dsRNA結合域。序列一致性分別為40．58％和26．027％，E值分別為E－21和1．8E－16，表明模型構建可靠。重組質粒的鑒定及重組蛋白的誘導表達與純化經酶切鑒定（見圖6）及測序鑒定，表明E3L重組載體構建正確。含有重組載體的BL21（DE3）pLysS重組菌在濃度為1mmol／L條件下誘導4h后，經E電泳分析，顯示在46ku處表達出一條明顯的條帶，分子質量與預期大小一致。經可溶性分析，表明重組蛋白主要以可溶形式存在于菌體中，經GST結合瓊脂可純化出目的條帶重組蛋白SPPVE3鼠抗血清的制備分析用綿羊痘病毒標準陽性血清和制備的鼠抗血清對SPPVE3蛋白進行分析，結果顯示所制備的鼠抗血清可以與重組蛋白發生反應。對制備的重組蛋白SPPVE3鼠抗血清進行間接ELISA檢測，其效價為。

3討論

蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子，主要由位于氨基酸末端的ZDBD和羧基末端的DRBD兩個關鍵的功能結構域組成。其中，E3蛋白的羧基末端能夠通過其dsRNA結合域阻斷病毒復制周期中產生的dsRNA，抑制了Toll樣受體、人視黃酸誘導基因／RIG樣受體以及細胞內PKR和OAS等各類抗病毒信號通路和抗病毒分子的活性，病毒得以正常復制。目前，除了VV外，E3蛋白的同源蛋白在羊口瘡病毒（ORFV）中已進行了較為深入的研究，結果顯示在體外細胞試驗中，ORFVE3蛋白取代VVE3蛋白后構建的重組病毒VV／ORFVE3與野生型VV致病性并無明顯差別，但在動物試驗中，的致病性顯著降低。等報道SPPV基因組的第34號開放閱讀框編碼VVE3蛋白的同源蛋白，表明SPPV可能編碼類似VVE3蛋白的免疫逃避因子。SPPV主要引起感染綿羊全身皮膚（特別是身體無毛部分）出現典型的痘瘡，造成家畜產奶量下降、體重減輕、流產率增加以及對肺炎和皮毛蠅蛆病的易感性增加，同時也會造成直接死亡。本試驗中，筆者以綿羊痘病毒甘肅古浪株為模板克隆出綿羊痘病毒E3L同源基因，基因全長534bp，編碼177個氨基酸。經過序列比對，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白核苷酸序列的一致性達到50．8％，而氨基酸序列一致性為34．9％（相似性為50．0％）。從功能結構域角度分析，SPPVE3蛋白與VVE3蛋白ZDBD的一致性只有28．2％（相似性為47．4％）；而DRBD一致性雖然高達41．9％（相似性為52．7％），但在決定dsRNA結合活性的和A174氨基酸殘基中，第174位氨基酸殘基中A→S的突變可能使其dsRNA結合活性大大降低，推測SPPVE3蛋白對干擾素的抑制效應將會減弱。在本研究中，以pGEX4T－1為載體，表達出大小為46ku左右的重組蛋白。利用純化后的重組蛋白免疫BALB／c小鼠獲得鼠抗血清，經間接ELISA測定效價為。利用制備的抗體能夠分析SPPV在感染細胞后E3蛋白的表達情況以及對PKR等抗病毒分子的影響，為闡明羊痘病毒的致病機理奠定了基礎。

作者：于少雄顏新敏吳國華趙志荀單位：中國農業科學院